产品目录

本试剂盒提供的FastAlteration DNA Polymerase是一种快速高保真DNA聚合酶，该酶保真性能优良，灵敏度高，扩增速度可达15～30sec/kb，并且最高可扩增长度为10kb的质粒DNA。试剂盒附带的FDM感受态细胞具有体内降解甲基化质粒的功能，可以对未被Dpn I降解掉的质粒模板进行进一步的降解，因此可以保证试剂盒具有更高的阳性率。同时，本试剂盒还为客户提供了对照质粒和引物，方便客户查找实验问题。

体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，多用于改造、优化目的基因；探索启动子的调节位点；以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。本试剂盒采用目前领先技术，可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变，多点突变及插入或缺失突变，并且单点突变的突变率可达90%以上。另外，与以往的突变试剂盒需要多轮PCR及亚克隆等耗时耗力的步骤不同，本试剂盒的操作更为简便，从未突变菌株到突变菌株的构建只需要4步，如下图所示：

• 简便快速：试剂盒采用非链取代式质粒扩增技术，只需4步即可实现由非突变菌株到突变菌株的转变，而不需要多轮PCR及亚克隆等耗时耗力的步骤。
  
• 高效引物：试剂盒采用部分重叠的引物设计原则，可以扩增得到更多的突变质粒。
  
• 应用广泛：本试剂盒不但可进行单点突变，还可以进行多点突变，且突变点数可达5个。
  
• 适应性强：本试剂盒最大可对10kb的质粒进行定点突变，基本覆盖所有常用质粒。
  
• 突变率高：本试剂盒具有体外和体内双重消化甲基化质粒模板的功能，可以保证更高的突变率。对于单点突变而言，本试剂盒的突变率可达90%以上。

• 改造优化目的基因和载体；
  
• 分析启动子上与调控蛋白结合的关键位点；
  
• 研究蛋白质结构和功能之间的关系。

组分	规格
FastAlteration DNA Polymerase(1U/μL)	20μL
5×FastAlteration Buffer	200μL
Dpn I restriction enzyme(20U/μL)	20μL
4.5kb Control plasmid(5ng/μl)	40μL
Control primers(5μM,each)	80μL
FDM competent cells	20×50μL

保存：-20℃，有效期1年，其中感受态细胞须置于-70℃，可保存6个月。

• 在进行单引物多位点突变时，由于增加了突变位点个数，所以突变率较单点突变时会有所降低，根据我们的实验数据，当突变位点个数达到5个时，突变阳性率会降低到50%。因此建议客户要增加验证的克隆子数。
  
• 本试剂盒支持多引物多位点突变，这样可以在基因内更广泛的范围内进行突变实验。突变位点个数的上限仍然是5个。
  
• 建议在进行新的突变实验时要带上试剂盒附带的对照质粒和引物，以便于对实验问题进行分析。

• 两条引物上都要包含突变位点，且除突变位点以外的碱基都要与质粒模板互补配对。
  
• 若引物中只有一个突变位点，则需采用图2-A的设计原则。此类引物包括5'重叠区和3'延伸区两部分。引物总长度大约为30nt，其中5'重叠区为15～20nt，3'延伸区至少为10nt。突变位点在正向突变引物的重叠区以后，反向突变引物的5'末端。
  
• 若引物上含有2～5个突变位点，则需采用图2-B的设计原则。此类引物的两条序列完全互补，分为突变区和非突变区两部分。引物总长度大约为40nt，其中突变区为15～20nt，非突变区至少10nt。根据实验需求可在突变区内设计2～5个突变位点。
  
• 为保证高突变率，突变引物需通过FPLC或PAGE方式纯化。
  
• 突变引物Tm值的计算按下列公式进行：
  Tm = 81.5 + 0.41(GC%) - 675/N - mismatch% (N:引物长度)
  
  图2．快速定点突变试剂盒引物设计原则

一、建立PCR反应体系
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模板、引物等的机构不同而各异，需根据实际情况，设定最佳反应条件。

• 将-20℃保存的PCR反应相关试剂，突变引物及模板质粒解冻并混匀。
  
• 按照下表中各成分的加入量配制反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  DNA Template	10～100ng	-
  正向突变引物(10μM)	2μL	400nM
  反向突变引物(10μM)	2μL	400nM
  5×FastAlteration Buffer	10μL	1×
  FastAlteration DNA Polymerase(1U/μL)	1μL	0.02U/μL
  RNase-Free ddH2O	至50μL	-

• 按照下表体系配制对照组PCR体系：
  

  成分	用量	终浓度
  4.5kb Control plasmid(5ng/μL)	2μL	0.2ng/μL
  Control primers(5μM,each)	4μL	400nM
  5×FastAlteration Buffer	10μL	1×
  FastAlteration DNA Polymerase(1U/μL)	1μL	0.02U/μL
  RNase-Free ddH2O	至50μL	-

• 将实验组及对照组按照如下PCR反应程序进行PCR反应。
  PCR反应程序：
  注：下表中PCR程序按照对照组实验条件设置，客户可根据自身实验进行相应调整。
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	2min	1
  变性	94℃	20sec	18
  退火	55℃	10sec
  延伸	68℃	2.5min
  补充延伸	68℃	5min	1

二、质粒模板的消化

• 按照下表所述配制酶切体系：
  

  成分	用量	终浓度
  PCR产物	50μL	-
  Dpn I restriction enzyme(20U/μL)	1μL	0.4U/μL

• 充分混匀后，将上述酶切体系于37℃条件下消化1h。

三、转化宿主菌
注：此转化流程为通用流程，可用于实验组及对照组。

• 从-90～-65℃冰箱中取出1支FDM感受态细胞置于冰上解冻。
  
• 感受态细胞解冻后，加入5μL Dpn I消化产物（在感受态细胞刚刚解冻时加入产物），继续冰浴30min。
  
• 42℃准确热激90sec，立即置于冰上2min。
  
• 加入350μL无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45～60min (150转／分钟），使菌体复苏。
  
• 孵育结束后，将离心管内菌液混匀，并将所有菌液涂布到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。
  
• 待菌落长出后，进行突变克隆筛选。

四、根据对照组统计突变结果
试剂盒提供的对照质粒和对照引物主要用于评估试剂盒的突变率。在氨苄抗性的平板上，涂布20μL 0.2M的IPTG和40μL 40mg/mL的X-gal，正常情况下，对照组在上述平板上的菌落生长数应该在50个以上，且阳性突变菌株显蓝色，因为对照质粒上的lacZ基因是经过改造的，而成功的突变会使其恢复成野生型。因此可根据菌落的颜色推断本次操作的阳性突变率，具体计算公式如下：

突变率＝	呈蓝色的菌落数(cfu)	×100%
	平板上所有的菌落数

注意：对于突变实验而言，需要通过测序来最终验证突变是否成功，及突变位点以外的碱基未发生改变。

问题	可能的原因	建议解决方法
转化效率低或菌落数少	反应体系中扩增出的突变质粒量不足	增加转化体系的量至10μL。
	PCR反应体系中模板质粒量不足	将模板质粒进行琼脂糖凝胶电泳及定量分析，以确定质粒的质量和浓度是否符合试剂盒要求。
对照组突变率低或者菌落数少	PCR程序不适宜	确定PCR程序适宜对照组要求，并用确定后的程序再进行—次对照组实验以彻底排除PCR程序的影响。
	扩增产物不足	可将PCR反应的循环数增加至25个。
	感受态细胞保存不当	收到试剂盒以后应第一时间将感受态细胞转入-90～-65℃冰箱中保存，且应将感受态放于冰箱的里面而不要放在门口。
	X-gal和IPTG的用量不足	对本试剂盒而言，应在氨苄抗性的平板上，涂布20μL 0.2M的IPTG和40μL 40mg/mL的X-gal，才能保证阳性突变株的菌落变为蓝色。
	5×PCR反应Buffer反复冻融	此Buffer中含有dNTP等容易降解的成分，反复冻 融会加速这些物质的降解，因此，在实际操作中应尽量避免对5×PCR反应Buffer的反复冻融。
实验组突变率低或者菌落数少	PCR程序不适宜	确定PCR程序适宜实验组要求，并用确定后的程序再进行一次对照组实验以彻底排除PCR程序的影响。
	反应体系混合不均匀	用移液器轻轻吸打将反应体系混合混匀。
	加入DpnI后未混匀充分	酶切阶段，加入Dpnl后一定要用移液器轻轻吸打多次以保证DpnI与PCR体系混合均匀。
	转化体系中质粒模板过剩	质粒模板过剩会极大的影响突变效率。若排除其他影响后，突变率仍然很低，可以考虑增加DpnI的用量至2μL或延长酶切时间至1.5h。
	5×PCR反应Buffer反复冻融	此Buffer中含有dNTP等容易降解的成分，反复冻融会加速这些物质的降解，因此，在实际操作中应尽量避免对5×PCR反应Buffer的反复冻融。

相关搜索：快速定点突变试剂盒，定点突变试剂盒，Fast Site-Directed Mutagenesis Kit